1.培养
肺炎支原体培养较为困难，需要特殊营养培养基，且生长速度较一般细菌慢许多。标本可为鼻咽拭子或吸液、痰、胸膜积液、支气管肺泡灌洗物、气管吸液和肺组织等。SP-4和改良的Hayflick肉汤和琼脂平板可用于肺炎支原体的培养。一般在接种过后4～20天出现菌落。
2.抗原检测
包括直接免疫荧光、免疫印迹和双单抗夹心酶免疫抗原捕获法，由于这些方法存在特异性/敏感性低，实际应用价值有限。
3.血清学检测
目前血清抗体诊断仍为国际上通用的诊断标准，肺炎支原体急性感染血清学诊断应包括IgG和IgM抗体。在成人患者，IgM抗体阳性是急性感染的指标，但阴性不能排除支原体感染，因为在此感染时IgM抗体可能缺失。IgG抗体可用于回顾性诊断，对于肺炎支原体肺炎的早期诊断价值不大。
4.基于核酸技术检测肺炎支原体的检测方法
如普通PCR、实时PCR等几乎能检测所有已知的人类致病支原体，使用最多的是16SrRNA的基因，具有很高的敏感性和特异性，而且检测方法快速、便捷，但感染后肺炎支原体的持续存在、无症状的肺炎支原体携带都可能造成假阳性，其中西医价值尚未完全确立。