蛋白质一级结构的测定方法(六)

2)酶解法肽谱重迭法

分析肽段也可采用酶解法,利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽,比较两种方法所得之肽段的重复性,进行氨基酸顺序的装配。例如,有一个肽段,通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜蛋白酶水解,则得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡肽。分析结果如下:

Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val

糜蛋白酶水解

+肽(Ala·Phe·Gly·Lys·Asn·Tyr·Arg·Trp·His·Val)

胰蛋白酶水解

Ala·Phe·Gly·Lys+Asa·Tyr·Arg+Trp·His·Val

将此两套寡肽可以做分析比较,因为十肽的N末端及C末端已事先测定分别为Ala及Val,因此第一段寡肽必然是Ala,Phe。

水解酶也可运用二肽酶,两组可用同一种酶水解如第一套肽是A桞,C桪,E桭,G桯……第二套肽水解则先将该肽段N端切去一个末位氨基酸,然后再开始二肽酶断裂,结果是A,B桟,D桬,F桮……这样分析比较也可排列出肽段顺序。

5.二硫键定位

蛋白质分子不经任何处理,直接用酶水解,检出其中二硫键的肽段,然后将二硫键拆开,分别测定两个肽的顺序,将此两肽结构与测出的一级结构比较,就能找出相应的二硫键的位置。

含二硫键肽的检出方法。

1)凝胶过滤或离子交换层析:用以分离各肽段,然后用特殊的二硫键显色反应找出含二硫键的肽。

2)对角线电泳或层析:1966年Brown及Hartlay提出用对角线电泳进行含-S-S-肽的定位,此方法是将水解后的肽混合物进行第一相电泳,样品点在中间,电泳毕,将样品纸条剪下,置于装有过甲酸的器皿中,用过甲酸蒸气处理2小时,使-S-S-断裂,此时含-S-S-肽段的静电荷发生了改变。然后将纸条缝于另一张纸上,进行第二相电泳电泳,电泳条件与第一相相同,只是与第一次方向成直角。在第二相电泳中,那些不含-S-S-的髣民泳情况与第一相相同,因此电泳后各肽斑均坐落在纸的对角线上,而那些含-S-S-的肽由于被氧化,电荷发生变化,第二相电泳速度就与第一相不同,电泳结果这些肽斑就偏离对角线,肽斑可用茚三酮显示。对角线法由于其速度快,操作简便以及能用于小分子样品,是直接分离-S-S-肽的好方法。

含-S-S-肽被分离后,即可进行肽段顺序分析,并与已测定的该蛋白质的一级结构进行比较,即可找出相应的-S-S-位置,至此蛋白质的一级结构基本阐明。

今后蛋白质一级结构的测定正朝自动化、快速化及微量化发展,关键问题仍然是进一步寻找蛋白裂解和肽分离的方法。

蛋白质一级结构的测定不断有新方法和新思路出现,如X衍射法测定一级结构;分离相应蛋白质的mRNA,由mRNA的一级结构排出蛋白质的一级结构等。这些大胆的设想必将有助于蛋白质的一级结构测定,使人们掌握更多的工具和方法去探索生命的奥秘。