DNA聚合酶Ⅰ

DNA聚合酶Ⅰ:

DNA polⅠ是由一条多肽链组成,分子量为109KD。酶分子中含有一个Zn++,是聚合活性必须的。

大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子,每个酶分子每分钟在37℃下能催化667个核苷酸参入到DNA链中,用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水介成两个片段,大片段分子量为76KD,通常称为klenow片段,小片段为34KD。大小片段具有不同的酶活性。

(一)DNA聚合酶的5′→3′聚合活性:

这是DNA聚合酶最主要的活性,按模板DNA上的核苷酸顺序,将互补的dNTP逐个加到引物RNA3′桹H末端,并促进3′桹H与dNTP的5′桺O4形成磷酸二酯键,酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用,5′→3′聚合活性存在于klenow片段上(图16-9和图16-10)。

图16-10 DNA聚合酶催化的DNA链延长

(二)DNA聚合酶的3′→5′外切核酸酶活性:

这种酶活性的主要功能是从3′→5′方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸,这种功能称为校对功能,这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的,因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的。

(三)DNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性:

这种酶活性是从DNA链的5′端向3′末端水解已配对的核苷酸,本质是切断磷酸二酯键,每次能切除10个核苷酸。因此,这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用,对完成的DNA片段去除5′端的RNA引物也是必须的。

DNA polⅠ的5′→3′聚合活性和5′→3′外切酶活性协同作用,可以使DNA一条链上的切口从5′→3′方向移动,这种反应叫做缺刻平移(nick translation),利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷(α-32PdNTP)的标记制成探针(probe),进行核酸的分子杂交实验,是现代分子生物学的一项重要技术