嘧啶核苷酸合成也有两条途径：即从头合成和补救合成。本节主要论述其从头合成途径。
(一)嘧啶核苷酸的从头合成
与嘌呤合成相比，嘧啶核苷酸的从头合成较简单，同位素示踪证明，构成嘧啶环的N1、C4、C5及C6均由天冬氨酸提供，C3来源于CO2，N3来源于谷氨酰胺。(图8-7)
图8-7 嘧啶环合成的原料来源
嘧啶核苷酸的合成是先合成嘧啶环，然后再与磷酸核糖相连而成的。
1.尿嘧啶核苷酸(UMP)的合成，由6步反应完成
(一)合成氨基甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)：嘧啶合成的第一步是生成氨基甲酰磷酸，由氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ(carbamoyl phosphate synthetase Ⅱ，CPS-Ⅱ)催化CO2与谷氨酰胺的缩合生成。正如氨基酸代谢中所讨论的，氨基甲酰磷酸也是尿素合成的起始原料。但尿素合成中所需氨基甲酰磷酸是在肝线粒体中由CPS-Ⅰ催化合成，以NH3为氮源;而嘧啶合成中的氨基甲酰磷酸在胞液中由CPSⅡ催化生成，利用谷氨酰胺提供氮源。
(二)合成甲酰天冬氨酸(carbamoyl aspartate)：由天冬氨酸氨基甲酰转移酶(aspartate transcarbamoylase，ATCase)催化天冬氨酸与氨基甲酰磷酸缩合，生成氨基甲酰天冬氨酸(carbamoyl aspartate)。此反应为嘧啶合成的限速步骤。ATCase是限速酶，受产物的反馈抑制。不消耗ATP，由氨基甲酰磷酸水解供能。
(三)闭环生成二氢乳清酸(dihydroortate)：由二氢乳清酸酶(dihyolroorotase)催化氨基甲酰天冬氨酸脱水、分子内重排形成具有嘧啶环的二氢乳清酸。
(四)二氢乳清酸的氧化：由二氢乳清酸还原酶(dihydroorotate dehyolrogenase)催化，二氢乳清酸氧化生成乳清酸(orotate)。此酶需FMN和非血红素Fe2+，位于线粒体内膜的外侧面，由醌类(quinones)提供氧化能力，嘧啶合成中的其余5种酶均存在于胞液中。
(五)获得磷酸核糖：由乳清酸磷酸核糖转移酶催化乳清酸与PRPP反应，生成乳清酸核苷酸(orotidine-5′-monophosphate，OMP)。由PRPP水解供能。
(六)脱羧生成UMP：由OMP脱羧酶(omp decarboxylase)催化OMP脱羧生成UMP。
Jones等研究表明，在动物体内催化上述嘧啶合成的前三个酶，即CPS-Ⅱ，天冬氨酸氨基甲酰转移酶和二氢乳清酸酶，位于分子量约210kD的同一多肽链上，是一个多功能酶;因此更有利于以均匀的速度参与嘧啶核苷酸的合成。与此相类似，反应(五)和(六)的酶(乳清酸磷酸核糖转移酶和OMP脱羧酶)也位于同一条多肽链上。嘌呤核苷酸合成的反应(三)、(四)、(六)，反应(七)和(八)及反应(十)和(十一)也均为多功能酶。这些多功能酶的中间产物并不释放到介质中，而在连续的酶间移动，这种机制能加速多步反应的总速度，同时防止细胞中其它酶的破坏。