有些物质(不包括蛋白质变性因子)能减弱或停止酶的作用，此类物质称为酶的抑制剂。抑制剂多与酶的活性中心内、外的必需基团结合，抑制酶的催化活性。如果能将抑制剂去除，酶仍表现其原有活性。
(一)不可逆抑制作用
抑制剂与酶活性中心的必需基团形成共价结合，不能用简单透析、稀释等方法除去，这一类抑制剂称为不可逆性抑制剂，所引起的抑制作用为不可逆性抑制作用。化学毒剂，如雾药1059、敌百虫等有机磷制剂即属此类。它们的杀虫或机体中毒作用主要是特异地与胆碱酯酶活性中心的丝氨酸羟基结合，使酶失浯。乙酰胆碱不能被失活的胆碱酯酶水解而蓄积，引起迷走神经持续兴奋发生中毒症状。
(二)可逆性抑制
抑制剂以非共价键与酶或中间复合物发生可逆性结合，使酶活性降低或消失，应用简单的透析、稀释等方法可解除抑制，这种抑制剂称为可逆性抑制剂。可逆性抑制剂引起的抑制作用为可逆性抑制作用。可逆性抑制作用的类型可分为下列三种。
1.竞争性抑制
有些可逆性抑制剂与底物结构相似，能和底物竞争酶的活性中心，使酶不能与底物结合，抑制酶促反应，称为竞争性抑制。这类抑制剂称为竞争性抑制剂。因为抑制剂与酶的结合是可逆的，所以酶促反应抑制程度取决于底物、抑制剂与酶的亲和力及二者浓度的相对比例。在竞争性抑制过程中，若增加底物的浓度，则竞争时底物占优势，抑制作用可以降低，甚至解除，这是竞争性抑制的特点。例如，琥珀酸脱氢酶可催化琥珀酸的脱氢反应，却不能催化丙二酸或戊二酸发生脱氢反应。但二者与琥珀酸结构类似，均为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。又如，磺胺类药物对多种细菌有抑制作用。这是因为细菌的生长繁殖有赖于核酸的合成，而磺胺药的结构与核酸合成时所需的四氢叶酸中的对氨基苯甲酸结构相似性，因而能与相应的酶竞争结合，抑制细菌。
当[S]足够高时，相对而言，竞争性抑制剂对酶的竞争性作用可忽略不计，此时几乎所有的酶分子均可与底物相作用，故仍可达到最大反应速度(Vmax)。然而，由于竞争性抑制剂的干扰，为达到无抑制剂存在时的反应速度，其所需的[s]将会升高;即在竞争性抑制剂存在时，酶与底物的亲和力下降，即Km值变大。
2.非竞争性抑制
有些非竞争性抑制剂可与活性中心外的必需基团结合，而不影响底物与酶的结合，两者在酶分子上结合的位点不同。这样形成的酶-底物-抑制剂复合物不能释放产物，这种抑制作用不能用增加底物的浓度消除抑制，故称非竞争性抑制。由于抑制剂不影响酶对底物的亲和力，故其Km值不变。但由于它与酶、ES复合物结合，等于减少了活性酶分子或酶分子总量，使Vmax降低。
3.反竞争性抑制
此类抑制剂与非竞争性抑制剂不同，它只能与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合。当ES与抑制剂结合后，能生成产物的ES减少，Vmax降低，这种抑制作用称为反竞争胜抑制。由于ES除了转变成产物外，又多了一条生成“废品”ES的去路，使E与S的亲和力增大，即其Km变小。