核酸酶是一种可经由催化磷酸双酯键的水解，而将DNA链切断的酵素。其中一种称为外切酶，可水解位于DNA长链末端的核苷酸;另一种则是内切酶，作用于DNA两个端点之间的位置。在分子生物学领域中使用频率最高的核酸酶为限制内切酶，可切割特定的DNA序列。例如左图中的EcoRV可辨识出具有6个碱基的5-GAT|ATC-3序列，并从GAT与ATC之间那条垂直线所在的位置将其切断。此类酵素在自然界中能消化噬菌体DNA，以保护遭受噬菌体感染的细菌，此作用属于限制修饰系统的一部分。在技术上，对序列具专一性的核酸酶可应用于分子选殖与DNA指纹分析。
另一种酵素DNA连接酶，则可利用来自腺苷三磷酸或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的能量，将断裂的DNA长链重新接合。连接酶对于DNA复制过程中产生的延迟股而言尤其重要，这些位于复制叉上的短小片段，可在此酵素作用下黏合成为DNA模板的完整复制品。此外连接酶也参与了DNA修复与遗传重组作用。