将目的基因或序列插入载体，主要靠DNA连接酶和双链DNA粘末端单链序列互补结合的配合使用。有以下主要的方式。
一、粘性末端连接
如果目的序列两端有与载体上相同的限制性核酸内切酶位点，则同一限制酶切开产生的粘末端，在降低温度退火时，能重新互补结合，在DNA连接酶催化下，目的序列就与载体DNA链相连接。
不同的限制性内切酶切，如果产生的DNA的粘末端相同，也同样可用此法连接，如识别6bp序列的BamHⅠ和识别4bp序列的Sau3aⅠ切割DNA后都产生5’突出粘性末端GATC，可以互补结合连接。
如果在连接的两个DNA片段没有能互补的粘性末端，可用末湍核苷酸转移酶催化脱氨单核苷酸添加DNA的3’末端，例如一般DNA3’端加上polyG，另一股DNA加上polyC，这样人工在DNA两端做出能互补的共核苷酸多聚物粘性末端，退炎后能结合连接(图20-6)，这样方法称为同聚物加尾法。
图20-6 同聚物加尾连拉法