以乙酰CoA为原料，在肝线粒体经酶催化先缩合，后再裂解而生成酮体，除肝之外，肾也含有生成酮体的酮体系。酮体的合成过程可分三步进行。
① 首先由两分子乙酰CoA在硫解酶的作用下缩合生成乙酰乙酰CoA，同时释放出一分子CoA-SH。
② 然后，乙酰乙酰CoA再与一分子乙酰CoA结合生成6个碳的3-羟甲基戊二酸单酰CoA(HMGCoA)，并释放出CoA-SH，此反应是由HMGCoA合成酶催化的，该酶在肝线粒体含量极高。
③ 乙酰乙酸被还原生成β-羟丁酸，该还原反应是由紧密结合在线粒体内膜上的β-羟丁酸脱氢酶(此酶在肝中活性极高)催化，还原反应所需的氢由NADH提供。该反应速度取决于NADH/NAD+ 之比值。部分乙酰乙酸还可缓慢地自发脱羧，亦可经乙酰乙酸脱羧酶催化脱羧生成丙酮。