糖异生途径基本是糖酵解的逆反应过程。糖酵解途径中大多数反应是可逆的，但由己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶催化的反应是不可逆的，必须通过其他的酶催化，才能越过这三个不可逆反应进行糖异生。
1.丙酮酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸，反应由两步反应组成，分别由丙酮酸羧化酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化。乳酸、丙氨酸及三羧酸循环的中间产物在进行糖异生时都需要通过这条通路。
2.1，6一双磷酸果糖转变为6一磷酸果糖，此反应由果糖二磷酸酶催化，从而越过了糖酵解中由磷酸果糖激酶催化的第二个不可逆反应。
3.6磷酸葡萄糖水解为葡萄糖，此反应由葡萄糖一6一磷酸酶催化，从而越过了糖酵解中由己糖激酶(葡萄糖激酶)催化的第一个不可逆反应。
由此可见，参与糖异生反应的关键酶有丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、呆糖二磷酸酶和葡萄糖一6一磷酸酶。