脂肪酸的β-氧化方式是脂肪酸氧化分解的主要方式，主要过程如下：
1.脂肪酸的活化——脂酰CoA的生成脂肪动员的主要产物是游离脂肪酸。它在氧化分解前需先在胞液中的内质网或线粒体外膜上活化成活泼的脂酰CoA才能进一步转变。催化此反应的酶为脂酰CoA合成酶，反应需消耗ATP。
2.脂酰COA转入线粒体催化脂肪酸氧化的酶系均存在于线粒体基质中，活化的脂酰CoA分子必须在线粒体内才能进行氧化分解，但脂酰CoA分子自身不能穿过线粒体内膜，需经肉毒碱载体转运。
线粒体内膜外侧含有肉毒碱一脂酰转移酶I，内侧含有肉毒碱一脂酰转移酶Ⅱ，二者为同工酶。在内膜外侧酶工催化下，脂酰Coa的脂酰基转移到肉毒碱上生成脂酰一肉毒碱，后者通过膜上载体的作用进入线粒体内。继而在内膜内侧酶Ⅱ催化下，脂酰一肉毒碱释出脂酰基，并与辅酶A一起重新在线粒体基质中生成脂酰CoA，而肉毒碱则回到线粒体内膜外侧再参加脂酰基的移换反应。
此转运过程是脂肪酸氧化的限速步骤，肉毒碱胡旨酰转移酶工是限速酶。在某些生理及病理情况下，如饥饿、高脂低糖膳食或糖尿病等，体内糖氧化利用降低，此时该酶活性增强，脂肪酸氧化分解供能增多。
3.饱和脂肪酸的β-氧化脂酰CoA进入线粒体基质后，从脂酰基的8碳原子开始。经过脱氢、加水、再脱氢和硫解四步连续的酶促反应，脂酰基断裂产生1分子乙酰CoA和1分子比原来少两个碳原子的脂酰CoA。由于此氧化过程发生在脂酰基的β碳原子上，故称为β-氧化。每一次p一氧化包括下面四个连续的酶促反应。
(一)脱氢：脂酰CoA在脂酰CoA脱氢酶催化下，在盯和8一碳原子上各脱去1个氢原子，生成a，β-烯脂酰CoA，脱下的氢由该酶的辅酶FAD接受生成FADH2。FADH2上的两个氢通过氧化呼吸链传递给氧生成水，同时伴有1，5分子ATP的生成。
(二)加水：c[，p一烯脂酰CoA在烯脂酰CoA.水合酶催化下加水，生成L-B一羟脂酰CoA。
(三)再脱氢：L_p一羟脂酰CoA在β-羟脂酰CoA脱氢酶催化下，脱去13碳上的2个氢原子，生成口一酮脂酰CoA。脱下的氢由该酶的辅酶NAD+接受，生成NADH+H-，后者经电子传递链氧化生成水及2.5分子ATP。
(四)硫解：β-酮脂酰CoA在β-酮脂酰CoA硫解酶催化下，加1分子辅酶A使碳链断裂，生成1分子乙酰CoA.和比原来少两个碳原子的脂酰CoA。
脂酰CdA经口一氧化的连续四步反应后，每次生成1分子乙酰CoA，碳链缩短两个碳原子，同时伴有5分子ATP生成。再重复进行fj_氧化，长链偶数碳原子的脂肪酸可生成若干分子的乙酰CoA，同时产生若干还原型的FAIDH：和NADH+H+。以16碳的饱和脂肪酸(软脂肪酸)为例，它生成脂酰CoA后，经7次p一氧化可生成8分子乙酰CoA，7分子FADH2和7分子NADH+H-。
在线粒体内分解代谢过程中，经脂肪酸B氧化产生的乙酰CoA可进人三羧酸循环进一步氧化成cO2和H2O，每一循环生成10分子ATP。因此1分子软脂肪酸彻底氧化分解可产生108分子ATP，减去活化时消耗的2个高能磷酸键相当于2分子ATP，净生成106分子ATP。因此脂肪酸是机体的重要能源。