(一)质粒DNA的提取及鉴定
1.收获细菌
(一)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。
(二)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。
(三)吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
2.碱裂解法小量抽提质粒
(一)将细菌沉淀[上述步骤(三)所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ(50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA)中，剧烈振荡。
(二)加200μl新配制的溶液Ⅱ(0.2mol/l NaOH, 1%SDS)，缓和振荡，水浴5min。
(三)加150μl预冷溶液Ⅲ(50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)，缓和振荡，冰浴5min。
(四)4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。
(五)可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，(四)。
(六)用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。
(七)4℃以12000g离心5min。
(八)小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。
(九)用75%乙醇于4℃洗涤DNA，同上离心去上清真空抽干。
(十)加50μl的1×TE(含20μg/ml无DNA酶的胰RNA酶)，振荡，贮存于-20℃。
(二)质粒DNA的大量制备
(一)同上1.(一)
(二)将1ml含菌液倒入含相应抗生素的Lb 100ml中，37℃振荡培养至A590=1.0(5～6h)。
(三)加氯霉素(170μg/ml)扩增，37℃温箱中培养过夜。
(四)收集菌液于离心管中，冰浴10min。3000rpm,离心10min，去上清。
(五)加溶液Ⅰ5ml悬浮菌体，将悬液倒入高速离心管中，摇匀，冰浴5min。
(六)加溶液Ⅱ10ml轻轻混匀，室温下5min。
(七)加溶液Ⅲ7.5ml轻轻混匀，冰浴30min。15000rpm，4℃离心20min。
(八)取上清液于高速离心管中，加2倍体积的无水乙醇，混匀，入-20℃3～5h。
(九)15000rpm 4℃ 离心20min。
(十)弃上清，将离心管倒放入真空泵中抽干(10～15min)。
(十一)用5ml1×TE溶解，加入RNase A 15～20μl，42℃水浴4h于过夜。
(十二)加入5ml饱和酚，混匀，4000～5000rpm离心5min，取上清液入5ml离心管内。
(十三)分别加入2.5ml饱和酚，2.5ml氯仿，混匀后同样离心收集上清。
(十四)加等体积氯仿/异戊醇(24：1)混匀，同样离心收集上清。
(十五)加入1/10体积的3mol/l NaAc及2倍体积的无水乙醇于-20℃3～5h。
(十六)10000rpm 4℃离心20min。
(十七)弃上清，加入75%乙醇洗涤2次。
(十八)离心弃上清，真空抽干，加入适量1×TE溶解质粒DNA。
(三)质粒DNA的鉴定
1.酶切反应
(一)在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混匀，37℃水浴1h以上。
(二)取反应物点样，观察酶切效果。
(三)酶切完全后，70℃5min终止反应。
2.琼脂糖电泳
(一)配制所需浓度琼脂糖凝胶。
(二)在待测的DNA样品中加1/5体积的溴酚蓝指示剂，混匀后点样。
(三)打开电源开关，5V/cm电泳。
(四)在UV灯下观察电泳结果。