质粒

质粒

质粒(plasmid)是许多种细菌中发现的染色体外的遗传因子，它是闭合环状的双链DNA分子，大小从1kb直到200kb以上。质粒所带的基因通常有利于宿主细胞。例如基因的产物是某些抗生素或对某些抗生素的抗性、能降解某些复杂的有机化合物、产生大肠杆菌素和肠毒素、产生限制酶或修饰酶等。

在天然条件下，许多种质粒是通过类似于细菌接合的过程传递给新的宿主。在实验室条件下，质粒则可通过转化过程进入受体细胞。此时，受体细胞已经过处理而处于感受态，即它的细胞暂时易于让小的DNA分子透过。受体细胞由于质粒的进入而产生了新的表型。如对某种抗生素的抗性，这样就可用这种抗生素作为选择条件，选出被质粒转化的受体细胞。

质粒复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。有些质粒处于“严紧控制”之下，即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。另一些质粒则是处于“松弛控制”之下的“松弛型”质粒。每个细菌中可以有10～200份拷贝。更重要的是松弛型质粒的拷贝数，可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份。宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止。但松弛型质粒仍继续进行复制。因此在增殖松弛型质粒时，总是要让宿主菌经氯霉素处理(在培养液中加入适量的氯霉素)抑制蛋白质的合成。

(一)大肠杆菌质粒

应用的最广泛的质粒载体是pBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。它全长4352个核苷酸，排列顺序已全部测定，基本结构如图23-3。

当需要用pBR322来克隆Bam HI酶切的一个DNA片段时外源DNA片段同pBR322都经Bam HⅠ酶切，所以有相同的单链“粘性末端”，通过DNA连接酶可以构成重组DNA分子。由于pBR322的Bam HⅠ酶切点在四环素的抗性基因中，所以Bam HⅠ酶切后使这个抗性基因失活。如果酶切后的质粒pBR322自身又重新连接，则恢复对四环素的抗性，转化子就仍然具有对二种抗生素的抗性。如果pBR322中插入外源DNA，则转化子失去了四环素抗性表型，而只有对氨苄青霉素的抗性，这样就可根据转化子的抗性而把重组质粒转化的细菌选出，然后扩增细菌，大量回收质粒DNA，从而达到大量扩增外源DNA的目的。

(二)真核生物中的质粒

真核生物中的酵母是国内外广泛研究的载体-受体系统之一。这是一个共价闭环DNA分子(cccDNA)，平均周长2μm，所以称为2μm DNA质粒，在每个酵母细胞里约有100个拷贝。已有人把2μm DNA同pBR322 DNA构建成双功能质粒，可在大肠杆菌和酵母菌中复制。这种质粒带有啤酒酵母的二个基因(his 3和Leu 2)，所以很容易用酵母的营养缺陷型菌株来选出。