PCR操作范例

在一个典型的PCR反应体系中需加入:适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg2+和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min,引物与模板40~60℃退火1min,72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3~5min;在末次循环后,样品仍需继续延伸3~5min以上,确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成,加入量和反应条件,使人们以此为基础,对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件

扩增条件:94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25~30个循环。

注:[1]反应缓冲液[10×]含:100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃),

15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl2,

0.01%(W/V)明胶(Sigma G2500)

[2]酶储存缓冲液(-20℃)含:50%甘油,100mmol/l KCl,

20mmol/L Tris-HCl ph8.0

0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT

200μg/ml明胶

0.5%吐温20,0.5% Nonidet P40

[3][4]引物,1,2:扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段

引物1序列:7131~7155(5’)-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’)

引物2序列:7606~7630(5’)-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’)

注意(3’)端有2个bp互补故易生成50bp的双体