真核细胞蛋白质合成起始复合物的形成中需要更多的起始因子参与，因此起始过程也更复杂。
(一)需要特异的起始tRNA即，-tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。已发现的真核起始因子有近10种(eukaryote Initiation factor,eIF)
(二)起始复合物形成在mRNA5’端AUG上游的帽子结构，(除某些病毒mRNA外)
(三)ATP水解为ADP供给mRNA结合所需要的能量。真核细胞起始复合物的形成过程是：翻译起始也是由eIF-3结合在40S小亚基上而促进80S核糖体解离出60S大亚基开始，同时eIF-2在辅eIF-2作用下，与Met-tRNAfmet及GTP结合，再通过eIF-3及eIF-4C的作用，先结合到40S小亚基，然后再与mRNA结合。
mRNA结合到40S小亚基时，除了eIF-3参加外，还需要eIF-1、eIF-4A及eIF-4B并由ATP小解为ADP及Pi来供能，通过帽结合因子与mRNA的帽结合而转移到小亚基上。但是在mRNA5’端并未发现能与小亚基18SRNA配对的S-D序列。目前认为通过帽结合后，mRNA在小亚基上向下游移动而进行扫描，可使mRNA上的起始密码AUG在Met-tRNAfmet的反密码位置固定下来，进行翻译起始。
图18-9 Initiation of translation im E.cole.The initiating tRNA,tRNAMetf,is represented by the blue line,the anticodon being the horizontal short line.The fMet-tRNAMetf is delivered to the 30s subunit by IF2.NNN represents any codon (N for any nucleotie).Note.The ribosome also has an exit site not shown in the diagram.This site will be discussed later.
通过eIF-5的作用，可使结合Met-tRNAfmet·GTP及mRNAR40S小亚基与60S大亚基结合，形成80S复合物。eIF-5具有GTP酶活性，催化GTP水解为GDP及Pi，并有利于其它起始因子从40S小亚基表面脱落，从而有利于40S与60S两个亚基结合起来，最后经eIF-4D激活而成为具有活性的80SMet-tRNAfmet·mRNA起始复合物。
图18-11 Simplified diagram of initiation in eukaryotes.Note that several eukaryote initiation factors besides elF2 are involved .tRNAMeti,initiating RNA.e1F2 is the eukaryotic initiation factor corresponding to IF2 in prokaryotes.