应用最普遍，效果可靠。高压蒸气灭菌器可分为下排气式和预真空式两类。后者的灭菌时间短，对需要灭菌的物品的损害轻微，但价贵，应用未普及。目前在国内广泛应用的为下排气式灭菌器，灭菌时间较长。这种灭菌器的式样很多，有手提式、立式和卧式等多种。但其基本结构和作用原理相同，由一个具有两层壁的能耐高压的锅炉所构成（图2－1），蒸气进入消毒室内，积聚而产生压力。蒸气的压力增高，温度也随之增高。用蒸气压力104.0～137.3kPa（15～20 lbf/in2）时，温度可达121～1260C，维持30分钟，即能杀死包括具有顽强抵抗力的细菌芽胞在内的一切细菌，达到灭菌目的。
高压蒸气灭菌器的使用方法略述如下：将需要灭菌的物品放入消毒室内，紧闭器门。先使蒸气进入夹套，在达到所需的控制压力后，将冷凝水泄出器前面的冷凝阀旋开少许，再将总阀开放，使蒸气进入消毒室。冷凝阀的开放是使冷凝水和空气从消毒室内排出，以确保消毒室所需的温度。此时，可看到夹套的蒸气压力下降，消毒室的蒸气压力上升。在消毒室温度表达到预选温度时，开始计算菌时间。灭菌时间终了后，让消毒室内的蒸气自然冷却或予以排气。在消毒室压力表下降到“0”位1～2分钟后，将门打开。再等10～15分钟后取出已灭菌的物品。由于余热的作用和蒸发，包裹即能干燥。物品灭菌后，一般可保留2周。
注意事项：①需要灭菌的各种包裹不应过大、过紧，一般应小于55cm×33cm×22cm；②放入灭菌器内的包裹，不要排得太密，以免妨碍蒸气透入，影响灭菌效果；③包内和包外各贴一条灭菌指示带（长约6～8cm），如压力达到时候15分钟时，指示纸带上即出现黑色条纹，表示已达灭菌的要求。包内放入用纸包好的升华硫磺粉物的检测温度的方法，因为所用的硫磺品种不同，多数的熔点为114～1160C，故结果有时并不可靠；④易燃和易爆炸物品如碘仿、苯类等，禁用高压蒸气灭菌法；锐利器械如刀、剪不宜用此法灭菌，以免变钝；⑤瓶装液体灭菌时，要用玻璃纸和纱布包扎瓶口，如用橡皮塞的，应插入针头排气；⑥已灭菌的物品应做记号，以便识别，并需与未灭菌的物品分开放置，以免弄错；⑦要有专人负责，每次灭菌前，应检查安全阀的性能是否良好，以防锅内压力过高，发生爆炸教，育网搜集整理。
高压蒸气灭菌法多用于一般能耐受高温的物品，如金属器械、玻璃、搪瓷、敷料、橡胶类、药物等灭菌。各类物品灭菌所需的时间、温度和压力。