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蛋白质的结构及蛋白质的功能(五)
(二)蛋白质空间橡象与功能活性的关系蛋白质多种多样的功能与各种蛋白质特定的空间构象密切相关,蛋白质的空间构象是其功能活性的基础,构象发生变化,其功能活性也随之改变。蛋白质变性时,由于其空间构象被破坏,故引起功能活性丧失,变性蛋白质在复性后,构象复原,活性即能恢复。在生物体内,当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合,触发该蛋白质的构象发生一定变化,从而导致其功能活性的变化,这种现象称为蛋白质的别… -
蛋白质一级结构的测定方法(一)
研究蛋白质的一级结构从确定组成蛋白质的单元结构棗氨基酸算起,已有150年的悠久历史,直到1955年,Sanger首次阐明胰岛素的氨基酸排列顺序,为研究蛋白质的一级结构开辟了道路。这在分子生物学的发展进程中是一个重要突破。目前关于核酸的一级结构研究,由于Sanger等发明了加减法,可以得到了突飞猛进的发展。对此之下,关于蛋白质的一级结构研究进展不如核酸迅速。但随着Edman液相自动顺序分析仪和固相… -
蛋白质一级结构的测定方法(二)
2)末端分析 其方法较多,这里我们只介绍较常用的几种。(一)N-末端测定A.二硝基氟苯法(FDNB,DNFB):1945年Sanger提出此方法,是他的重要贡献之一。 DNP-氨基酸用有机溶剂抽提后,通过层析位置可鉴定它是何种氨基酸。Sanger用此方法测定了胰岛素的N末端分别为甘氨酸及苯丙氨酸。B.氰酸盐法:1963年Stank及Smyth介绍了一种测定N末端的新方法, 由于乙内酰脲氨基酸不… -
蛋白质一级结构的测定方法(三)
(二)C-末端分析A.肼解法:这是测定C-末端最常用的方法。将多肽溶于无水肼中,100℃下进行反应,结果羧基末端氨基酸以游离氨基酸状释放,而其余肽链部分与肼生成氨基酸肼。这样羧基末端氨基酸可以采用抽提或离子交换层析的方法将其分出而进行分析。如果羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺如天冬酰胺和谷氨酰胺,则肼解时不能产生游离的羧基末端氨基酸。此外肼解时注意避免任何少量的水解,以免释出的氨基酸混淆末端分析。B.… -
蛋白质一级结构的测定方法(四)
2)酶解法酶水解法较化学法具有更多的优越性,使用也更广泛。因其具有较高专一性,而且水解产率较高,所以可以选择各种不同专一性的酶进行专一性的断裂。常用的酶有胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶和嗜热菌蛋白酶。胰蛋白酶专一断裂Lys,Arg的羧基侧肽键,如果对Lys,Arg,CysH进行化学修饰可改变胰蛋白酶的断裂性质。(一)赖氨酸的修饰。将Lys用顺丁烯二酸酐或甲基顺丁烯二酸杆修饰,则胰蛋白酶仅使Arg肽键… -
蛋白质一级结构的测定方法(五)
3.肽段的分离大部分肽段的分离主要通过凝胶过滤法,由于大分子肽溶解度小。往往采用甲酸、醋酸、丙酸等有机溶剂使之溶解。单用凝胶过滤法分离之肽一般纯度不高,常需辅以离子交换层析法,大片段肽可用离子交换葡聚糖作载体,小肽则多用Dowex-50等树脂。小肽分离还常采用高压电泳与层析相结合的指纹图谱法,得到纯净肽。4.肽的顺序分析在蛋白质一级结构的测定中,肽的顺序分析是比较重要的一步。肽的顺序分析也有化学法… -
蛋白质一级结构的测定方法(六)
2)酶解法肽谱重迭法分析肽段也可采用酶解法,利用专一性不同的两种酶将一个肽分别断裂成更小的寡肽,比较两种方法所得之肽段的重复性,进行氨基酸顺序的装配。例如,有一个肽段,通过氨基酸组成分析已知其为十肽,假如先以糜蛋白酶水解,则得到一套寡肽,再以胰蛋白酶水解此十肽,得到另一套寡肽。分析结果如下:Ala·Phe+Gly·Lys·Asn·Tyr+Arg·Trp+His·Val糜蛋白酶水解+肽(Ala·P… -
酶的作用特点和特异性
酶是生物催化剂(biological catalyst),具有两方面的特性,既有与一般催化剂相同的催化性质,又具有一般催化剂所没有的生物大分子的特征。酶与一般催化剂一样,只能催化热力学允许的化学反应,缩短达到化学平衡的时间,而不改变平衡点。酶作为催化剂在化学反应的前后没有质和量的改变。微量的酶就能发挥较大的催化作用。酶和一般催化剂的作用机理都是降低反应的活化能(activation energy)… -
酶促反应动力学(一)
酶促反应动力学(kinetics of enzyme-catalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。这些因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。在研究某一因素对酶促反应速度的影响时,应该维持反应中其它因素不变,而只改变要研究的因素。但必须注意,酶促反应动力学中所指明的速度是反应的初速度,因为此时反应速度与酶的浓度呈正比关系,这样避免了反应产物… -
酶促反应动力学(二)
(二)米-曼氏方程式的推导米-曼氏方程式提出后又经riggs和Haldane的充实和发展,经补充和发展的米-曼氏方程工推导如下:(一)式中K1、K2、K3、K4分别为各向反应的速度常数。从式(一)中知,ES的生成途径来自E+S和E+P,但其中E+P生成ES的速度极小(尤其在起始阶段,P的生成很少),可以忽略不计,又因为底物浓度大大超过酶的浓度,[S]》[E],中间产物ES中的S浓度可以忽略不计… -
酶促反应动力学(三)
三、pH对反应速度的影响酶反应介质的pH可影响酶分子,特别是活性中心上必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态,也可影响底物和辅酶的解离程度,从而影响酶与底物的结合。只有在特定的pH条件下,酶、底物和辅酶的解离情况,最适宜于它们互相结合,并发生催化作用,使酶促反应速度达最大值,这种pH值称为酶的最适pH(optimum pH)。它和酶的最稳定pH不一定相同,和体内环境的pH… -
酶促反应动力学(四)
五、抑制剂对反应速度的影响凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白变性的物质称做酶的抑制剂(inhibitor)。使酶变性失活(称为酶的钝化)的因素如强酸、强碱等,不属于抑制剂。通常抑制作用分为可逆性抑制和不可逆性抑制两类。(一)不可逆性抑制作用(irreversible inhibition)不可逆性抑制作用的抑制剂,通常以共价键方式与酶的必需基团进行不可逆结合而使酶丧失活性,按其作用特点,又有专一性及… -
别构机制的模式(一)
为了解释别构酶协同效应的机制并推导出动力学曲线的方程式,不少人曾提出过各种模式,各有优缺点,现在主要把Hill模式叙述如下:Hill模式在协同结合模式中最早的一种是Hill在1909年提出的,企图解释氧结合至血红蛋白的S形饱和曲线,现称为Hill模式,后来经Atkinson应用于别构酶反应,他设想在这个系统中,n分子的配体(S)能够一步结合到酶上去:即此反应的总解离常数(K's)由下式决… -
别构机制的模式(二)
Hill作图法的斜率n,称为Hill系数,即前述的协同系数,一般可用nH或h代表。当nH=1时,式6-1变为V=Vm[S]/(K1+[S]),即米曼氏方程式,表示无协同作用,此时K'或S0.5S,=S0-5=Km,至于nH>1为正协同,nH<1为负协同。Hill模式比较简单,式6-1或式6-10都是S形曲线方程式,但有不少缺点:(一)按理,Hill系数应等于酶分子中可能有结合…