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限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系,切断核酸的情况不同,分为三类:Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成,兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性,它能识别和结合于特定的DNA序列位点,去随机切断在识别位点以外的DNA序列,通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+,S腺苷甲硫氨酸及ATP。Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似,是多亚蛋白质,既有内切酶活性,又有修饰酶活性… -
限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征,切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同,结果有三种不同的情况:①产生3’突出粘性末端(cohesive end):以Eoor 为例:5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'… -
PCR-SSCP分析技术
近几年来,在PCR基础上完善和发展起来的多种基因变异检测方法是基因分析和检测的一次技术革命。其中日本学者创建的PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism anal-ysis of PCR products)格外重要。它是指单链DNA分子在变性PAGE中电泳迁移率随其构象的改变而改变的性质。单链DNA分子的构象改变即可由DNA多态性引起,又可由基… -
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聚合酶链式反应(PCR)
如果已经知道目的基因的序列,就能很方便地用PCR聚合酶链式反应,polymerase chain reaction,从基因组DNA或cDNA中获得目的基因,可不必要经过复杂的DNA文库构建过程。PCR是70年代中期创立的技术,其基本原理如图20-10所示。图20-10 PCR基本原理示意图PCR反应系统包括含有目的基因或序列的DNA模板,对热稳定的DNA聚合酶,一对脱氧寡核苷酸引物、DNA合成所需… -
分子克隆化的另一些酶
(一)DNA聚合酶(DNa polymerase)的作用是将1个脱氧三磷酸核苷酸加到引物(primer)的3’-OH上,释放出一个焦磷酸分子(ppi),如下式表示。聚合酶主要有以下几种:1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 大肠杆菌DNA聚合酶(E.Coli DNA polymerase)主要有3种作用:①5’→3’的聚合作用。但不是复制染色体而是修补DNA,填补DNA上的空隙或是切除RNA引物后留下的空…