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质粒DNA的提取及鉴定
(一)质粒DNA的提取及鉴定1.收获细菌(一)将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中,接入一单菌落,于37℃剧烈振荡培养过夜。(二)将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中,用台式离心机于4℃以12000g离心5min,将剩余的培养物贮存于4℃。(三)吸尽培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。2.碱裂解法小量抽提质粒(一)将细菌沉淀[上述步骤(三)所得]重悬于100μl预冷的… -
地高辛配基随机标记DNA探针法
(一)概述基因诊断是以核酸分子杂交技术为基础,在核酸水平检测人类遗传性疾病的基因缺陷和一些传染病病原体的方法。其基本过程是:制备DNA探针,标记探针,检测样本。开展这项工作的关键是要得到高灵敏度、高特异性的探针。以往人们是用放射性同位素来标记探针DNA。近年来,非同位素标记方法发展很快,已有取代同位素标记法的趋势。地高辛配基随机标记DNA探针法,是较为成功的一种非同位素标记方法。其原理是:用化学方… -
真核细胞基因组DNA的制备
从不同组织细胞或血细胞中提取DNA是进行基因诊断的先决条件。制备DNA的原则是既要将蛋白质、脂类、糖类等物质分离干净,又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K的应用使这两个原则得到了保证。在提取DNA的反应体系中,SDS是离子型表面活性剂,主要作用是:(一)溶解膜蛋白而不破坏细胞膜;(二)解聚细胞中的核蛋白;(三)与蛋白质结合,使蛋白质变性而沉淀下来。蛋白酶K可将蛋白降解成小的多肽和氨基酸,使DNA分子… -
根据重组载体的标志作筛选
最常见的载体携带的标志是抗药性标志,如抗氨芐青霉素(anpr)、抗四环素(terr)、抗卡那霉素(kanr)等。当培养基中含有抗生素时,只有携带相应抗药性基因载体的细胞才能生存繁殖,这就把凡未能接受载体DNA的细胞全部筛除掉了。如果外源目的序列是插入在载体的抗药性基因中间使这抗药性基因失活,这个抗药性标志就会消失。例如质粒pBR322含有anpr、和terr两个抗药基因,若将目的序列插入terr基… -
目的基因序列克隆的筛选与鉴定
目的序列与载体DNA正确连接的效率、重组导入细胞的效率都不是百分之百的,因而最后生长繁殖出来的细胞并不同都带有目的序列。一般一个载体只携带某一段外源DNA,一个细胞只接受一个重组DNA分子。最后培养出来的细胞群中只有一部分、甚至只有很小一部分是含有目的序列的重组体(recombinant)。将目的重组体筛选出来就等于获得了目的序列的克隆,所以筛选(dcreening)是基因克隆的重要步骤。在构建载… -
DNA限制性内切酶图谱分析
这是在上述筛选后的进一步分析。目的序列插入载体会使载体DNA限制性酶图谱(restriction map)发生变化,例如一个长600bp的目的序列利用它两端的EooR I和SalI切后的粘末端连接插入pUC19的多克隆点,则重组质粒就增大为3.3kb,用Eoor I和SalI双酶切后会出现600bp和-2.7kb两个DNA片段,提取转化细菌的质粒DNA作酶切后做电泳观察其酶切图谱,就能分析得结果;… -
"DNA指纹"和法医鉴定
1979年Teffreys根据β珠蛋白基因座位近旁出现的RFLP频率同测定的核苷酸总数,推算出人体基因组的遗传异质性约为每100个核苷酸中有一个差异。后在人体DNA随机片段的文库中分离出高度变异的超变区。从1982年起,分别在人的胰岛素基因,α类珠蛋白基因,肌动蛋白基因和C-Ha-ras-1基因中陆续发现了这些超变区。这是一些很短的顺序或称“小卫星顺序”串联重复所组成。不同等位基因的重复数目也不相… -
蛋白质变性、沉淀与凝固
蛋白质的二级结构以氢键维系局部主链构象稳定,三、四级结构主要依赖于氨基酸残基侧链之间的相互作用,从而保持蛋白质的天然构象。1.变性:在某些物理和化学因素作用下,蛋白质特定的空间构象被破坏,从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失的现象称为蛋白质的变性。蛋白质变性后溶解度下降、容易消化生物活性丧失。2.沉淀:蛋白质从溶液中析出的现象称为蛋白质沉淀。蛋白质变性后,疏水侧链暴露在外,肽链融汇相互缠绕继而… -
DNA生物的代谢演化
DNA所包含的遗传讯息,是所有现代生命机能,以及生物生长与繁殖的基础。不过目前尚未明了在长达四十亿年的生命史中,DNA究竟是何时出现并开始发生作用。有一些科学家认为,早期的生命形态有可能是以RNA作为遗传物质。RNA可能在早期细胞代谢中扮演主要角色,一方面可传递遗传讯息;另一方面也可作为核糖酶的一部分,进行催化作用。在古代RNA世界里,核酸同时具有催化与遗传上的功能,而这些分子后来可能演化成为目前… -
拓扑异构酶和螺旋酶简述
拓扑异构酶是一种同时具有核酸酶与连接酶效用的酵素,可改变DNA的超螺旋程度。其中有些是先使DNA双螺旋的其中一股切开以形成缺口,让另一股能穿过此缺口,进而减低超螺旋程度,最后再将切开的部位黏合【45】。其他类型则是将两股DNA同时切开,使另一条双股DNA得以通过此缺口,之后再将缺口黏合。拓扑异构酶参与了许多DNA相关作用,例如DNA复制与转录。螺旋酶是分子马达的一种类型,可利用来自各种核苷三磷酸,… -
血糖神经系统调节作用
神经系统对血糖的调节主要通过下丘脑和植物神经系统调节其所控激素的分泌,进而再影响血糖代谢中关键酶的活性,达到调节血糖浓度的作用。(一)下丘脑的腹内侧核:通过兴奋交感神经①作用于肾上腺髓质,引起肾上腺素释放;②作用于胰岛α细胞,分泌胰高血糖素;以及③直接作用于肝,活化肝细胞的磷酸化酶,促进肝糖原分解和糖异生,从而使血糖浓度升高。(二)下丘脑外侧核:作用与内侧核相反,它通过兴奋迷走神经,①促进胰岛β细… -